用品及準(zhǔn)備

　　材料 ①50μl加樣器；②250μl加樣器；③微量反應(yīng)板；④倒置顯微鏡；⑤醫(yī)用液體石蠟油；⑥尼龍纖維棉和聚乙稀塑料管（管徑6mm，長(zhǎng)160mm）。

　　試劑

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　?、谕醚a(bǔ)體，無(wú)天然細(xì)胞毒性，效價(jià)合格的混合兔血清。

　?、?%伊紅-Y溶液。

　?、?2%福馬林（pH7.0～7.4）。

　?、輰?duì)照組：陽(yáng)性對(duì)照，用兔抗人淋巴細(xì)胞血清和抗B淋巴細(xì)胞血清；陰性對(duì)照，滅活正常人AB型混合血清。

　　⑥淋巴細(xì)胞分離液（比重1.077±0.02）。

　　⑦Hanks液（pH6.8～7.4）。

　?、?0%小牛血清-RPM1640培養(yǎng)液。

　　⑨淋巴細(xì)胞洗滌液和淋巴細(xì)胞保存液。

　　方法及內(nèi)容

　?。?）向Terasaki反應(yīng)板的每孔加10μl液體石蠟油。

　?。?）每反應(yīng)板最后兩孔分別加陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清，其余每孔加已知或待檢血清1μl.

　　（3）每孔加的淋巴細(xì)胞懸液或B淋巴細(xì)胞懸液1μl，并輕輕搖動(dòng)，使其與抗血清完全混勻。

　?。?）室溫（20℃±2℃）培養(yǎng)30min，B細(xì)胞置于37℃溫育箱1h。

　?。?）每孔加兔補(bǔ)體5μl，充分混勻，室溫培養(yǎng)1h，B細(xì)胞2h。

　?。?）每孔加入5％伊紅Y3μl，作用1～3min。

　?。?）每孔加入12％福馬林8μl，室溫靜置1～2h或4℃冰箱過(guò)夜，置顯微鏡下觀察結(jié)果。

　　注意事項(xiàng)

　　對(duì)淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)方法有影響的因素很多，所以一般需做多個(gè)復(fù)本。

　?。?）淋巴細(xì)胞：①純度：沾染的顆粒細(xì)胞可吸收抗體，紅細(xì)胞及血小板可使計(jì)數(shù)時(shí)間減慢，而引起計(jì)數(shù)誤差。②濃度：細(xì)胞濃度過(guò)低，無(wú)法計(jì)數(shù)，其準(zhǔn)確性大大下降，細(xì)胞濃度大，造成淋巴細(xì)胞集聚成團(tuán)，影響結(jié)果。③pH值：中性為宜，過(guò)酸影響細(xì)胞致敏，過(guò)堿易造成假陽(yáng)性。

　　（2）抗血清：細(xì)胞溶解和抗血清效價(jià)低也是引起計(jì)數(shù)誤差的常見(jiàn)原因。

　　（3）加入補(bǔ)體要充足，以克服抗補(bǔ)體因子。

　?。?）染料：離心除去沉淀物與雜質(zhì)。

　　（5）控制培養(yǎng)溫度與時(shí)間。