用品及準(zhǔn)備

　　基本同淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)。

　　方法及內(nèi)容

　?。?）刺激細(xì)胞的處理：有兩種方法，一種是將受試細(xì)胞懸液用60Co或X射線40Gy照射后的細(xì)胞直接接種。另一種是使用絲裂霉素處理。向細(xì)胞懸液內(nèi)加入絲裂霉素（終濃度40mg/ml），置37℃水浴30min，然后用RPM1640培養(yǎng)液洗滌3次。最后將細(xì)胞懸浮于1640培養(yǎng)液中計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×10⁶/ml。

　?。?）準(zhǔn)備微量加樣器，用75%酒精、無(wú)菌雙蒸水、無(wú)菌生理鹽水依次各洗3遍。

　?。?）預(yù)先準(zhǔn)備無(wú)菌96孔圓底板，寫(xiě)好標(biāo)簽。

　?。?）按照雙向和單向混合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)接種細(xì)胞。①雙向微量混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC-D）對(duì)照組，AA、BB每孔加A細(xì)胞100μl或B細(xì)胞100μl，實(shí)驗(yàn)組：AB每孔加A細(xì)胞50μl，B細(xì)胞50μl。②單向微量混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC-S）。對(duì)照組：AAm、BBm每孔加反應(yīng)細(xì)胞50μl，自身刺激細(xì)胞50μl；實(shí)驗(yàn)組：ABm、BAm每孔加反應(yīng)細(xì)胞50μl，刺激細(xì)胞50μl，每孔總液量為100μl，每種組合3～4個(gè)復(fù)管。

　?。?）培養(yǎng)板置于37℃、含5%CO₂濕潤(rùn)空氣環(huán)境中培養(yǎng)5d。

　?。?）5d后每孔加入2μl（36kBq）3H-TdR，繼續(xù)37℃培養(yǎng)。

　　（7）18h后，用細(xì)胞收集器將放射性樣品收集于玻璃纖維濾紙上，水洗20s，空吸10s。

　　（8）將樣品濾紙置于60～80℃烤箱烘干后，移至裝有2～3ml閃爍液的測(cè)量杯中，待測(cè)。

　　（9）用β液體閃爍測(cè)量?jī)x，測(cè)量每份樣品的放射性計(jì)數(shù)（CPM）。

　　結(jié)果判讀

　　計(jì)算刺激指數(shù)SI

　　因本底CPM值都控制在100以下，故本底CPM值可忽略不計(jì)。一般無(wú)關(guān)個(gè)體之間MLC的SI＞10。