1. 引言

成體干細胞是指存在于成年機體組織器官中的具有自我更新和多向分化潛能的細胞?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)多種成體組織中都存在著干細胞[1]，早在1987 年，McCulloch[2]即提出牙周韌帶中可能存在有前體細胞，這些細胞可能源自骨髓基質，通過血管通道進入牙周韌帶，定位于牙周韌帶血管周圍及骨韌帶間隙。到2004 年，Seo BM等人[3] 成功的從人的阻生牙上分離出PDLSC，他們首先對其橫向分化潛能和表型作了研究，證明它具有多向分化的干細胞特點，同時將細胞與羥基磷灰石/磷酸三鈣（HA-TCP）粉混合植入免疫缺陷小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)能夠形成牙周韌帶牙骨質復合體樣結構，并首次提出了牙周干細胞的概念，表明了牙周韌帶干細胞的潛能。

我們對牙周韌帶干細胞進行分離、培養(yǎng)，并進行礦化。局部微環(huán)境對干細胞的增殖和分化起關鍵性作用。在體外，培養(yǎng)條件則成為調控細胞分化方向的關鍵，國內外研究均表明干細胞在體外誘導液的作用下能夠多向分化[4， 5].礦化液是骨髓基質干細胞體外誘導向成骨細胞分化的有效途徑。對于牙周韌帶干細胞礦化誘導前后的變化，是本實驗將要探討的問題。

2. 材料與方法

2.1 實驗用品

2.1.1 主要試劑

細胞培養(yǎng)試劑、儀器、免疫細胞化學試劑盒同前。礦化液為含10%胎牛血清，10－6M地塞米松，50μg/ml α-抗壞血酸（ascorbic acid） （Amesco，USA），10mM β-甘油磷酸鈉（β-glycerophyosphate，β-GP） （Sigma，USA）的DMEM.BSP 抗體（NIDCR LW.Fisher 博士惠贈 ）；ALP 活性檢測試劑盒（南京建成）；其余試劑均為分析純。以正常牙周韌帶細胞作為對照組。

2.1.2 實驗用液的配制

β-甘油磷酸鈉： 取2.16g 溶于10m1 三蒸水。配成1 mol/L（100 x）的貯備液濃度。0.2μm 濾膜過濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。地塞米松及其貯備液配制： 配成1 mol/L 的貯備液濃度。0.2μm 濾膜過濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?

2.2 方法

2.2.1 細胞培養(yǎng)和克隆分離

參照Seo的方法[3]，采用膠原酶和disPase酶聯(lián)合消化法進行牙周韌帶干細胞的原代培養(yǎng)。具體簡述如下：組織塊法：取臨床上10-15 歲因正畸而拔除的無齲病和牙周病的前磨牙，刮取牙根中1/3 處的牙周膜，剪成1mm2 大小的組織塊，均勻地鋪于培養(yǎng)瓶底，加入1mlDMEM培養(yǎng)液， 孵育4 小時，待組織塊貼牢瓶底后，輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。每3 天換液一次，直至細胞從組織塊周圍游出、待細胞匯合后用0.25%胰蛋白酶消化。酶消化法：同上法取組織塊，用3mg/ml的I型膠原酶和4mg/ml的Dispase酶在37oC消化lh，輕輕吹打離散單細胞團塊， 100μm的細胞篩網過濾，800 r.p.m離心5 min，重懸，以1 x 105/ml的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置5%CO2、飽和濕度的37oC恒溫孵箱中培養(yǎng)。72h后首次換液，以后每3天換液l次。每日在倒置顯微鏡下觀察，待細胞生長達80%～90%匯合時，胰酶消化傳代。細胞計數板計數細胞濃度，調整后以1-2 個細胞／孔的濃度接種于96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)7-14 天，至出現(xiàn)細胞克隆（細胞數≥50 為判定標準）后胰酶消化，逐步分別擴大培養(yǎng)，常規(guī)傳代或凍存。

2.2.2 礦化誘導和VonKossa 染色

制備第3 代人牙周韌帶干細胞及牙周韌帶細胞懸液，以1×106cells /ml 的密度接種于6孔板，礦化液連續(xù)培養(yǎng)14 天，中止培養(yǎng)，0.01M 冷PBS 沖洗三遍，4%中性福爾馬林固定后進行Von Kossa 染色，觀察礦化結節(jié)形成情況，步驟依次為：5%硝酸銀染色，紫外燈下照射10～15 min，去離子水洗20 min，5%亞硫酸鈉還原1 min，1%中性紅襯染，常規(guī)脫水封片，光鏡觀察。

2.2.3 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測

將兩種細胞接種于24 孔板，礦化液連續(xù)培養(yǎng)14 天，棄去礦化液，0.01M 冷PBS 沖洗三遍，每孔加入細胞裂解液200μl，室溫振蕩10min，收集上清液，檢測細胞的ALP 活性。用Lawry 法測蛋白含量，結果以ALP 活性/每克蛋白表示。

2.2.4 免疫組化檢測骨唾蛋白表達

將兩種細胞接種于6 孔板，礦化液連續(xù)培養(yǎng)14 天，中止培養(yǎng)，4%中性福爾馬林固定后常規(guī)免疫組化檢測骨唾蛋白表達。

3. 結果

3.1 礦化結節(jié)染色結果

克隆來源細胞用礦化液連續(xù)培養(yǎng) 14 天后，肉眼觀可見白色點狀物，倒置顯微鏡下細胞呈復層生長，局部形成白色的礦化結節(jié)，Von Kossa 染色顯示其染成褐紅色的大小不等的礦化結節(jié)，周邊細胞界限不清，中央區(qū)為紅黑色，周圍逐漸變淺。對照組細胞雖然形成細胞結節(jié)，但Von Kossa 染色陰性。

3.2 ALP 活性檢測結果

細胞經14 天礦化液誘導培養(yǎng)后，其ALP 活性與礦化結節(jié)的形成能力一致。t 檢驗結果表明克隆來源細胞的ALP 活性明顯高于對照組細胞（P<0.05）。

3.3 免疫細胞化學檢測結果

誘導前細胞抗BSP 染色為陰性，誘導后抗BSP 染色呈陽性，對照組誘導后抗BSP 染色呈陰性。

4. 討論

牙周組織中包含著兩種礦化組織[6]：骨和牙骨質，盡管這兩種硬組織的礦化機制及礦化程度不盡相同，但它們的基本成分十分類似。兩者的礦化成分都主要為羥基磷灰石和無定型磷酸鈣，而礦化基質大部分為I型膠原和少量的非膠原蛋白。兩者的非膠原蛋白成分也大體相同，主要有骨鈣素（osteocalcin OCN）、骨橋素（osteopontin OPN）、及骨睡液蛋白（bonesialoprotein BSP）等。同時，形成兩種礦化組織的成牙骨質細胞和成骨細胞也有相似之處，不僅都具有體外礦化的能力，對不同信號因子的反應也極為類似。因此，區(qū)別兩種細胞具有一定難度醫(yī)`學教育網搜集整理。

骨唾蛋白（Bone sialoprotein）是一種高度糖基化和硫酸化的磷蛋白，是骨基質的主要非膠原蛋白之一，是礦化組織特異性蛋白[7]，雖然在無細胞牙骨質和細胞牙骨質中也有表達，但其在成熟的骨形成細胞中表達更明顯，因此是成骨細胞分化的晚期標志。本研究免疫組化結果顯示骨唾蛋白大量表達，也說明了PDLSCs具有向成骨細胞分化的能力。堿性磷酸酶（ALP）是一種較為肯定的參與促進鈣化活動的酶類。但是，目前關于ALP在牙骨質的表達還是個有爭議的問題[8].但ALP在骨細胞中的表達是毫無疑問的，因此，我們把ALP看作是PDLSCs分化為骨形成細胞的標志。在本實驗中，礦化誘導后的克隆組細胞ALP活性明顯高于對照組，說明PDLSCs分化為成骨細胞數量相當大，并具有成骨的潛在能力。礦化結節(jié)的大量形成也說明了這一點。