檢驗原理

金霉素是一種高效廣譜抗生素，對多種病原菌有較強的抑制作用，常用于動物各種傳染性疾病的治療。但其在動物肉、奶、蛋等食品中的殘留嚴重威脅人體健康，能引起再生障礙性貧血和粒狀白細胞缺乏癥等疾病，低濃度的藥物殘留還會誘發(fā)致病菌的耐藥性。歐盟、美國等許多國家已明確禁止CAP用于生產(chǎn)動物源性食品，并制定了嚴格的限量標準。加入WTO后，農(nóng)、獸藥殘留日益成為各發(fā)達國家限制中國農(nóng)副產(chǎn)品出口的技術(shù)壁壘。2002年1月30日，歐盟委員會以從中國進口的蝦仁中檢出金霉素為由，發(fā)布2002/69/EC決議，禁止中國動物源性食品進口，直接造成中國水產(chǎn)品出口6億多美元的經(jīng)濟損失。

金霉素等半抗原（分子量<1000Da）的檢測方法，通常采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）及高效液相色譜（HPLC）及氣-質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）等方法。然而，這些方法需要較長的實驗時間及相應(yīng)昂貴的實驗設(shè)備，主要被限制在實驗室中使用。隨著人們對食品安全的日益重視和進出口貿(mào)易的高速增長，迫切需要一種能快速、穩(wěn)定地檢測農(nóng)、獸藥殘留的方法。膠體金免疫層析試條因其使用方便已被廣泛用于小分子物質(zhì)的診斷檢測，目前已經(jīng)開發(fā)出用于鏈霉素、磺胺嘧啶等農(nóng)、獸藥殘留檢測的試紙條。本實驗開發(fā)了一種快速檢測金霉素殘留的免疫層析試紙條，具有靈敏度高，操作快捷，不需要附加設(shè)備等優(yōu)點，適用于加工企業(yè)對原輔材料驗收，人員用藥，成品分析以及養(yǎng)殖場對投入品的檢測等工作。

材料與方法

1.1材料氯金酸（HauCl4·4H2O）、金霉素標準品、牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000購于SIGMA公司；抗金霉素單克隆抗體（MAb），購于Biodesign公司（免疫原為KLH與金霉素的偶聯(lián)物，鼠源性）；水溶性碳二亞胺（EDC）、金霉素琥珀酸鈉鹽，購于Fluka公司；羊抗鼠IgG購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司；金霉素ELISA檢測試劑盒購于EURO-DIOGNOSTICA公司；Bradford蛋白定量試劑盒購于Bio-Rad公司；BioJet XYZ3000型點膜儀購于美國BioDot公司；硝酸纖維素膜（NC）、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊購于Millipore公司。1.2膠體金的制備及抗金霉素Mab的金標記膠體金顆粒的大小平均為30nm，參照文獻制備膠體金顆粒，在100ml去離子水中加入1%檸檬酸三鈉1ml，煮佛后迅速加入1%氯金酸1ml，繼續(xù)煮佛10min，冷卻后，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取已制備好的膠體金溶液100ml，用0.1mol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8.0。邊攪拌邊加入抗金霉素MAb1.5mg，攪拌20min，再逐滴加入2ml25mg/ml聚乙二醇20000（PEG20000），攪拌15min。20000 r/min離心15min，棄上清液，加入10mlpH7.4PBS緩沖液（含0.4mg/mlPEG）清洗2次。將沉淀用5ml含2%BSA的PBS緩沖液（Ph7.4）溶解，用0.22μm無菌過濾器過濾后，4℃保存?zhèn)溆谩?.3樣品制備金霉素標準樣品配制以甲醇配成100μg/ml標準貯液，后以超純水稀釋成各濃度梯度。

肉類樣品預(yù)處理取10g均質(zhì)過的試樣，加入10mlPBS，37℃混合保溫90 min后，3000r/min離心20 min，收集上清液備用。

牛奶樣品預(yù)處理取5ml新鮮牛奶，放入離心管中，10℃3500r/m離心10 min，吸除上層的脂肪層，取去脂牛奶用PBS適當稀釋后備用。

將上述試樣處理液與各種濃度的金霉素標準品按不同體積比混合成所需濃度的試樣。部分實際待測試樣的處理方法參考荷蘭EURO-DIAGNOSTICA金霉素檢測試劑盒產(chǎn)

品試樣處理方法。1.4金霉素全抗原的合成包被抗原為金霉素與BSA的偶聯(lián)物（CAP-BSA），其合成方法為活性酯法及疊氮法，參見文獻，其中活性酯法為：先將20mg氯毒素琥珀酸鹽、15mgEDC及30mgBSA混合溶于1ml Tris緩沖液中，0~4℃下避光攪拌1h，再加入5mgEDC，在0℃下攪拌反應(yīng)12h，靜置過夜后，后用Tris緩沖液透析3d。

將合成的CAP-BSA全抗原稀釋成100μg/ml（蛋白濃度），后做200~300nm波長的紫外掃描，參照楊利國介紹的計算方法測算偶聯(lián)比，即CAP與載體蛋白BSA的摩爾比。其中BSA濃度以BRADFORD蛋白定量試測定。

用EURO-DIOGNOSTICA公司的ILISA試劑盒檢測金霉素濃度，操作方法參見產(chǎn)品說明書。在450nm波長處測A值，計算抑制率：

抑制率=B/B0×100%B0為不含待測試樣中金霉素的吸光值，B為含待測試樣中金霉素吸光值。

1.5試紙條組裝用點膜機把適當濃度的CAP-BSA及羊抗鼠IgG噴在NC膜上，分別作為檢測線（T）和控制線（C），在37℃烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標記CAP單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。

試紙條組成為一個PVC背板，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用帶MARK膠帶繞背板覆蓋在樣品墊、膠體金結(jié)合墊及吸水墊上。用切割機將貼好的板切割成3mm寬的條，放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。

1.6檢測方法將CAP檢測試紙條帶MARK線的一端插入裝有待測試樣的容器中，使試樣溶液沿膜從下往上移動。5min以后，即可判讀結(jié)果。

結(jié)果與討論

2.1檢測結(jié)果的判讀試紙條的組成如圖1所示。當樣品墊端放入檢測試樣時，由于毛細作用液體向前移動。到達T線時，試樣中的金霉素與固定在T線上的CAP-BSA復(fù)合物競爭結(jié)合抗金霉素MAb-膠體金復(fù)合物，若試樣中金霉素濃度小于1ng/ml，則膠體金結(jié)合墊中的抗金霉素MAb-膠體金復(fù)合物與T線上CAP-BSA及C線上羊抗鼠IgG大量結(jié)合，T線呈色與c線相近，結(jié)果為陰性；若試樣中金霉素的濃度大于1ng/ml，則抗金霉素MAb-膠體金復(fù)合物基本上與檢測試樣中的金霉素結(jié)合，不能與T線上的CAP-BSA結(jié)合，因此T線將比c線淺很多或完全看不到線，而且試樣中金霉素濃度越高T線顯色越淺，結(jié)果為陽性。如檢測正確進行的話，控制線總會顯示紅色線條。2.2CAP-BSA人工抗原合成本試紙條檢測線所用的包被抗原為CAP-BSA偶聯(lián)物，由本實驗室人工合成。偶聯(lián)反應(yīng)后所得產(chǎn)物經(jīng)紫外光譜分析，參照文獻所介紹的方法計算其偶聯(lián)比率。多次實驗所得抗原的偶聯(lián)比率在1：10~40左右，部分數(shù)據(jù)見表1。由表1可以看出，BSA與CAP偶聯(lián)后最大吸收峰都發(fā)生藍移，可能是其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化及環(huán)境極性增大的原因。對金霉素與BSA的偶聯(lián)是否成功，還采用競爭抑制ELISA檢測來判斷。按梯度稀CAP-BSA偶聯(lián)物，后由CAP-BSA與CAP標準品競爭結(jié)合金霉素抗體。

金霉素標準品對不同濃度CAP-BSA的抑制率，隨著CAP-BSA稀釋倍數(shù)的升高（CAP-BSA含量減少）酶標金霉素標準品對其的抑制率升高。即CAP-BSA與酶標金霉素競爭結(jié)合金霉素抗體，表明抗原偶聯(lián)是成功的。本實驗還對CAP抗原的合成方法采用了活性酯法與疊氮法，并比較其對T線的影響。由于疊氮法合成的疊氮化合物為淡黃色物質(zhì)，干擾T線顯色，因此不適用作為檢測線的包被抗原。而活性酯法合成的偶聯(lián)物CAP-BSA1~3，以相同的BSA濃度包被T線，控制線都能與金標記的CAP抗體反應(yīng)出現(xiàn)明顯的紅色線條，適合做包被抗原。并發(fā)現(xiàn)其不同結(jié)合比對檢測的靈敏度有一定影響，見試紙條的調(diào)試部分。

2.3試紙條的調(diào)試將不同半抗原結(jié)合比、不同濃度的CAP-BSA和不同A值的金霉素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物分別包被在硝酸纖維素膜和膠體金結(jié)合墊上，反復(fù)調(diào)試，使最終的靈敏度達到所需的要求。其用量如下：金霉素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物采用A值為40（噴量2μg/cm）的包被量，檢測線CAP-BSA用量為0.1mg/ml（噴量0.75μl/cm），控制線羊抗鼠IgG用量為1mg/ml（噴量0.75μl/cm）。調(diào)試結(jié)果表明采用不同pH值5、6、7、8、9、10的樣品墊對試劑條的靈敏度沒有產(chǎn)生明顯影響。將硝酸纖維素膜用各種不同配比的溶液做封閉，發(fā)現(xiàn)試劑條的C、T線顯色都變淺，但對靈敏度和特異性沒有明顯影響，所以最終制備試劑條時沒有采用封閉的方案。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，用同樣的C、T線濃度、抗體-膠體金復(fù)合物A值和同樣的包被量，采用12μm和5μm這兩種不同比例的蔗糖和海藻糖，會對膠體金復(fù)合物從膠體金結(jié)合墊上的釋放能力產(chǎn)生影響，在一定范圍內(nèi)，加入的蔗糖和海藻糖的比例越高，膠體金復(fù)合物釋放得越快。

采用半抗原偶聯(lián)率比較高的CAP-BSA做成的試劑條靈敏度更高，這可能同偶聯(lián)比率高的CAP-BSA與金霉素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)的能力更強有關(guān)。但過高的半抗原結(jié)合比并不符合C、T線顏色對比這種判斷，反而使靈敏度下降。本試紙條金霉素的最低檢測水平（LDL）的判斷標準是當檢測線比控制線的顏色明顯淡時，試樣中金霉素的含量為1mg/ml。當試樣中的CAP濃度大于5ng/ml時，檢測線完全消失；當CAP濃度小于0.5ng/ml時，檢測線與控制線在肉眼下沒有明顯區(qū)別。本試紙條的LDL可達到1ng/ml。檢測限如再降低，容易出現(xiàn)假陰（陽）性的結(jié)果。由于其使用主要是在生產(chǎn)場所現(xiàn)場大批量初篩時定性檢測，此靈敏度可以滿足實際的篩選需要，如需可靠的定量結(jié)果還需在實驗室里做ELISA、HPLC等進一步檢測。

2.5檢測的特異性將金霉素琥珀酸鈉，甲砜霉素，磺胺二甲基嘧啶，四環(huán)素，青霉素，鏈霉素6種抗菌素溶于PBS（pH7.4，0.01mol/L），配成不同濃度，然后用試紙條檢測。結(jié)果如圖3所示，金霉素琥珀酸鈉及金霉素在低濃度下即不出現(xiàn)紅色T線。而后5者（類似物）即使在濃度大于100ng/ml時，也能見明顯的T線，可見與不同抗菌素的交叉反應(yīng)很低（因定性檢測不能給出交叉率的確切數(shù)值）。由于T線包被抗原是

以琥珀金霉素鈉鹽偶聯(lián)BSA而成，因此金霉素琥珀酸鈉與金霉素的這種交叉反應(yīng)是在意料之中的。因此免疫層析試紙條可以通過觀察試紙條上檢測線的有無及顏色變化進行定性檢測，對金霉素具有較高的特異性。2.6穩(wěn)定性試驗用同一批次不同試紙條檢測同一樣品，及用不同批次試紙條測定同一樣品，其質(zhì)控線、測試線的顯色時間及顏色深淺和最終結(jié)果判讀基本相同。利用該試紙條對含不同濃度金霉素殘留的蝦肉提取液試樣進行檢測并與ELISA的檢測結(jié)果比較，總共檢測50份（陽性30份，陰性20）。試紙條以1ng/ml為判斷限值，沒有出現(xiàn)假陽性及假陰性，檢測結(jié)果與ELISA結(jié)果完全相符。如把檢測限值再降低則易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，不能達到試紙條檢測穩(wěn)定性的要求。

免疫膠體金技術(shù)是20世紀70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。目前金標記技術(shù)常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗和免疫層析試驗等。免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診斷的一個重要發(fā)展方向，是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)。近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在臨床診斷特別是床邊檢測（POCT）中得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。目前已有些非臨床檢測的應(yīng)用，如毒素、藥殘留、環(huán)境監(jiān)測等。我們研制的金霉素膠體金免疫層析檢測試紙條可用于飼料、水產(chǎn)類、牛奶等的檢測，最低檢測含量（LDL）達到1ng/ml。相對于目前使用ELISA方法檢測金霉素樣品至少需要24h，費用約為300元/個，試紙條只需10min就可出結(jié)果，費用低廉，而且不需要附加實驗設(shè)備，能滿足養(yǎng)殖場所和加工企業(yè)對原輔材料、人員用藥及產(chǎn)品初篩等的檢測需要。但由于實驗樣品來源有限，檢測試紙條的各種參數(shù)，需在擴大樣品范圍與數(shù)量條件下做進一步的驗證。

【主要質(zhì)量指標】

金霉素含量：15%/20% 四環(huán)素含量：小于1.2%/1.6% 蛋白質(zhì)含量：20-50% 脂肪含量：2-4% 糖含量：小于2% 灰分：小于40% 水分含量：小于8% 重金屬含量：小于20ppm 砷鹽含量：小于2ppm 差向金霉素含量：小于0.9%/1.2% 酸堿度：5.0－7.5 粒度：250微米80%通過（粉狀）;250-850/90%通過（粒狀） 性狀：棕色至深棕色

【飼企用途】：

1. 本品為飼料添加劑抗生素。加在雛雞仔雞的飼料中可以促進生 長發(fā)育，縮短育成期，提高育成率。 2. 對金霉素敏感菌能起抑制作用，小劑量添加可以預(yù)防 疾病， 增大劑量可起治病作用。3. 低劑量添加即可達到促進腸道吸收功能，從而提高飼料轉(zhuǎn)化率。4. 本品是一種安全性高的抗菌素，只以低濃度添加就能產(chǎn)生效能，而擴大18倍劑量也不產(chǎn)生毒副作用。長期使用，長期有效，不產(chǎn)生抗藥性。 效能：1. 飼用金霉素能促進畜禽生長發(fā)育，提高飼料報酬率30%以 上，對0-8周齡雛雞可提高育雛率6.23%，增重11．94%，可預(yù) 防金霉素敏感菌引起的疾病。2. 飼用金霉素對革蘭氏陽性菌、陰性菌、其它巴氏桿菌、結(jié)核 桿菌等均有較強的抑制作用。對防治和治療雞白痢、傷寒、副傷 寒、霍亂、球蟲病、肺炎、腸炎、喘氣病及魚、蝦、蚌類的細菌 性疫病尤為顯著。本品與土霉素同屬四環(huán)類廣譜抗生素，但金霉 素促進生長和滅殺細菌能力大大優(yōu)于土霉素。