一、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取

　　質(zhì)粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項基本實驗技術(shù)，但提取方法有很多種，以下介紹一種最常用的方法：

　　堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：

　　1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細胞于2ml LB培養(yǎng)基。

　　2、37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

　　3、取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。

　　4、加0.lml溶液I（1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0）充分混合。

　　5、加入0.2ml溶液 II（0.2 mM/L NaOH，1％ SDS），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min .

　　6、加入0.15m1預(yù)冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min .

　　7、以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管

　　8、加入等體積的異戊醇，混勻后于？0℃靜置10min.

　　9、再以10，000rpm離心20min，棄上清。

　　10、用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

　　11、待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE緩沖液中

　　煮沸法

　　1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。

　　2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。

　　3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中， 渦旋混勻。

　　4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml）， 渦旋振蕩3秒鐘。

　　5、將eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

　　6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。

　　7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。

　　8、取20ml進行電泳檢查。

　　[注意] 1. 對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質(zhì)粒DNA.

　　2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時，細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。

　　3. 提取的質(zhì)粒DNA中會含有RNA，但RNA并不干擾進一步實驗，如限制性內(nèi)切酶消化，亞克隆及連接反應(yīng)等。

　　質(zhì)粒DNA的大量提取和純化

　　在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA，為此需要大量提取質(zhì)粒DNA.大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進一步純化，常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。

　?。ㄒ唬A法

　　1、取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的含pBS質(zhì)粒的細菌培養(yǎng)液250ml，4℃下5000g離心15分鐘，棄上清，將離心管倒置使上清液全部流盡。

　　2、將細菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中（此步可省略）。

　　3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。

　　4、將細菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中，充分懸浮菌體細胞。

　　5、加入12ml新配制的溶液II， 蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，冰浴10分鐘。

　　6、加9ml用冰預(yù)冷的溶液III， 搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物，冰上放置15分鐘，此時應(yīng)形成白色絮狀沉淀。

　　7、4℃下5000g離心15分鐘。

　　8、取上清液，加入50ml RNA酶A（10mg/ml）， 37℃水浴20分鐘。

　　9、加入等體積的飽和酚/氯仿，振蕩混勻，4℃下12000g離心10分鐘。

　　10、取上層水相， 加入等體積氯仿，振蕩混勻，4℃下12000g離心10分鐘。

　　11、取上層水相，加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG（分子量6000）， 冰上放置60分鐘。

　　12、4℃下12000g離心15分鐘， 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。

　　13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。

　　[注意] 1. 提取過程中應(yīng)盡量保持低溫。

　　2. 加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和，切忌劇烈振蕩。

　　3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐熱的特性，使用時應(yīng)先對該酶液進行熱處理（80℃ 1小時），使DNA酶失活。

　　二、質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定

　　瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，應(yīng)選用電泳純的，瓊脂糖此級產(chǎn)品篩除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙錠染色后熒光背景最小。

　　（1）瓊脂糖凝膠電泳裝置

　　由于瓊脂糖凝膠電泳既要求不高，而適應(yīng)性又強，在過去15年里已成功地設(shè)計了形形色色及大大小小的電泳槽。對這些裝置的選擇主要是依據(jù)個人的喜惡。使用最普遍的裝置是Walter Schaffner發(fā)明的水平板凝膠。

　　水平板凝膠通常在一塊可安放于電泳槽平臺的玻璃板或塑料盤上灌制。在有些裝置中，則可將凝膠直接鋪在平臺上。凝膠恰好浸在緩沖液液面下進行電泳。凝膠的電阻幾乎與緩沖液的電阻相同，所以有相當(dāng)一部分的電流將通過凝膠的全長。

　　（2）瓊脂糖凝膠的制備

　　瓊脂糖凝膠的制備是將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化成清澈、透明的溶液。然后將熔化液倒入膠模中，令其固化。凝固后，瓊脂糖形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。通貫?zāi)z的電場接通后，在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移。

　?。?）瓊脂糖凝膠的染色

　　電泳完畢，將瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移入含EB的染液中，染色10分鐘，取出紫外燈下觀察。

　　三、大腸稈菌感受態(tài)細胞的制備

　　感受態(tài)的細胞可以攝入外部溶液中的DNA，而常態(tài)的細胞卻不能，所以要轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA進入大腸桿菌必須首先制備感受態(tài)的大腸桿菌細胞。

　　1、取1%大腸桿菌E.coli接種于含2ml LB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜

　　2、取0.1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于含10ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)3h至OD600=0.3

　　3、然后把培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，冰浴10min.

　　4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液

　　5、把菌體懸浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min

　　6、然后再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液

　　7、將菌體懸浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。

　　四、質(zhì)粒DNA高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌

　　制備好感受態(tài)細胞后，接下來就是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細胞的過程。但要注意的是感受態(tài)細胞最好是新制備的，因為保存一定時間的感受態(tài)細胞會使轉(zhuǎn)化率降低；此外DNA的濃度也要注意，不能太高。

　　1、取新制備的一管感受態(tài)細胞。

　　2、取0.03ml感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)和4ng質(zhì)粒DNA混勻，置冰浴30min

　　3、將 Ep管置于42℃水浴中熱沖擊2分鐘，立即置于冰上1分鐘。

　　4、在 Ep管中加70u1 LB培養(yǎng)基混勻，37℃培養(yǎng)30min

　　5、涂在含適當(dāng)濃度抗生素的LB平板上。

　　6、37℃培養(yǎng)過夜，長出的菌斑既為陽性克隆。

　　五、線形質(zhì)粒DNA 5‘-粘性末端去磷酸

　　經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒DNA 5‘端均帶有磷酸集團，如用此載體直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其自身環(huán)化幾率非常高，影響連接、轉(zhuǎn)化效率。因此一般酶切的質(zhì)粒DNA要經(jīng)脫磷，使用堿性磷酸酶（CIAP）去除5’端磷酸集團。方法如下：

　　1、質(zhì)粒DNA和CIAP以及BUFFER 37℃水浴30min

　　2、補充CIAP 再37℃水浴30min

　　3、加入50mM EDTA至終濃度5mM 75℃加熱10min 失活CIAP

　　4、冷卻至室溫，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀濃縮。

　　5、抽干溶液，加適量TE溶解。

　　六、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)

　　PCR是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法。其特異性是由兩個人工合成的引物序列決定的。所謂引物就是與待擴增DNA片段兩翼互補的寡聚核苷酸，其本質(zhì)是ssDNA片段。待擴增DNA模版加熱變性后，兩引物分別與兩條DNA的兩翼序列特異復(fù)性。此時，兩引物的3‘端相對，5’向背。在合適的條件下，由Taq DNA聚合酶催化引物引導(dǎo)的DNA合成，既引物的延伸。上述過程是由溫度控制。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)。PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。理論上擴增產(chǎn)物量成指數(shù)上升，既n個循環(huán)后，產(chǎn)量為2n拷貝。典型的PCR操作過程如下：

　　1、 反應(yīng)體系：

　?。ǚ磻?yīng)溶液可置于毛細管或薄壁離心管中擴增）

　　2、操作過程：（所用儀器為AMP1605熱循環(huán)PCR擴增儀

　　預(yù)變性：94℃ 90秒

　　循環(huán)過程：94℃ 1秒 48℃ 1秒 72℃ 40秒  40個循環(huán)

　　延伸：72℃ 5分鐘

　　3、檢測：瓊脂糖電泳檢測。