【摘要】目的：研究脊髓背角膠質(zhì)層神經(jīng)元在超極化脈沖刺激下的細(xì)胞膜反應(yīng)性，揭示神經(jīng)元在超極化狀態(tài)下膜的基本性質(zhì)。 方法：在大鼠脊髓新鮮薄組織片上，利用脊髓薄片膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，記錄脊髓背角膠質(zhì)層神經(jīng)元接受超極化刺激后膜電位的變化情況。 結(jié)果：在電流鉗模式下，膜電位在超極化刺激結(jié)束后，從超極化電位水平恢復(fù)到靜息水平的過(guò)程中出現(xiàn)一個(gè)長(zhǎng)時(shí)程的對(duì)抗回到靜息水平的現(xiàn)象超極化反跳，該超極化反跳幅值的最大值為（16.5±3.8） mV；在電壓鉗模式下，同時(shí)可以記錄到一個(gè)對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)時(shí)程超極化激活的外向流，該外向流的最大幅值為：（45.0±2.1） pA，時(shí)程為：（475.0±0.8） ms. 該超極化反跳和超極化激活的外向流具有電壓依賴(lài)性，沒(méi)有時(shí)間依賴(lài)性。 結(jié)論：超極化刺激能引起大鼠脊髓膠質(zhì)層神經(jīng)元出現(xiàn)“超極化反跳”，該現(xiàn)象是神經(jīng)元在超極化狀態(tài)下的基本膜特性之一。

　　【關(guān)鍵詞】 反跳 脊髓 膠質(zhì)層 超極化 膜片鉗

　　0.引言

　　接受去極化刺激后能夠產(chǎn)生動(dòng)作電位一直是判斷細(xì)胞具有興奮性的唯一標(biāo)準(zhǔn)。 然而大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元在接受超極化刺激后也能爆發(fā)動(dòng)作電位。 “去極化反跳”現(xiàn)象對(duì)于神經(jīng)元的放電模式、節(jié)律活動(dòng)和突觸可塑性具有重要的調(diào)節(jié)作用 ［1-2］。 該現(xiàn)象作為神經(jīng)元的基本膜特性已在許多不同腦區(qū)的神經(jīng)元上記錄到，包括丘腦、小腦、海馬和脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 ［3-4］。 說(shuō)明神經(jīng)元在超極化狀態(tài)下還隱藏著一些尚未發(fā)現(xiàn)的性質(zhì)。 脊髓背角是接受來(lái)自傷害性感受器感覺(jué)纖維信息輸入的第一級(jí)中繼站。 膠質(zhì)層神經(jīng)元整合非傷害性和傷害性信息輸入，在感覺(jué)信息加工和轉(zhuǎn)換的可塑性中發(fā)揮著極其重要的作用［5］。 我們選擇脊髓背角作為研究對(duì)象，以探索神經(jīng)元在超極化狀態(tài)下的細(xì)胞膜特性。

　　1.材料和方法

　　1.1材料兩周齡新生SD大鼠，體質(zhì)量26～30 g，雌雄不限（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。 戊巴比妥鈉，NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4，CaCl2，NaHCO3，Glucose和Potassium gluconate （天津市醫(yī)藥公司產(chǎn)品）；記錄電極（南京泉水實(shí)驗(yàn)器材廠(chǎng)）；恒流泵（HL2型，上海滬西儀器廠(chǎng)）；振動(dòng)切片機(jī)（vibratome 1000 plus，美國(guó)Vibratome 公司）；顯微鏡（BX51WI，日本Olympus公司）；放大器（Multiclamp 700B，美國(guó)Axon公司）；模數(shù)轉(zhuǎn)換器（Digidata 1322A，美國(guó)Axon公司）；滲透壓儀（Model 501，美國(guó)Precision system 公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1脊髓薄片標(biāo)本制作手術(shù)開(kāi)始前準(zhǔn)備混合氣飽和的冰浴人工腦脊液，用預(yù)先制備的瓊脂切出一個(gè)表面有條淺溝的瓊脂塊，將分裝的明膠置于40℃的恒溫條件下備用。 戊巴比妥鈉（30～40 mg/kg）麻醉動(dòng)物，以角膜反射為指標(biāo)，觀(guān)察動(dòng)物的麻醉程度。 待動(dòng)物麻醉后，將其俯臥置于冰板上。 沿脊柱中線(xiàn)切開(kāi)皮膚，分離結(jié)締組織與肌肉。 從胸段至腰骶段行椎板切除術(shù)，暴露的脊髓立即用混合氣飽和的冰浴人工腦脊液覆蓋。 快速取出胸腰骶段脊髓，約2 cm長(zhǎng)，移入冰浴人工腦脊液中，然后處死動(dòng)物。 解剖顯微鏡下剝?nèi)ボ浖鼓?，除一?cè)的L4背根保留外，其余的背根與腹根盡皆剪除。 將帶背根的脊髓置于瓊脂塊的淺槽內(nèi)，將預(yù)熱的明膠滴在脊髓塊的胸腰段上對(duì)標(biāo)本進(jìn)行半包埋。 將瓊脂塊黏在切片機(jī)的載物臺(tái)上，在預(yù)先冰浴的人工腦脊液中進(jìn)行切片。 首先背根保持自然下垂，在手術(shù)顯微鏡下調(diào)整刀片的位置，在靠近背根進(jìn)入處切片，移去上段。 再用小毛筆將背根刷向上，刀片下降250～300 μm再次切片，即可得到帶背根的脊髓薄片。 將得到的脊髓標(biāo)本移入混合氣飽和的人工腦脊液中，24～26℃下孵浴最少1 h，然后開(kāi)始記錄。

　　1.2.2紅外線(xiàn)可視全細(xì)胞記錄實(shí)驗(yàn)用Olympus正置顯微鏡配有5×物鏡（數(shù)字孔徑為0.10），40×浸水物鏡（數(shù)字孔徑為0.80），IR～DIC透鏡。 將脊髓切片移至記錄用灌流槽內(nèi)，用黏有平行細(xì)尼龍絲的U形鉑絲固定。 在記錄過(guò)程中，灌流速度保持在2～3 mL/min，溫度24～26℃。 灌流槽置于顯微鏡載物臺(tái)上，用5×物鏡觀(guān)察脊髓切片的分層，40×觀(guān)察細(xì)胞進(jìn)行可視封接。 本實(shí)驗(yàn)中，一般記錄距離切片表面80～100 μm深度的脊髓背角神經(jīng)元。 紅外線(xiàn)可視條件下，狀態(tài)良好的神經(jīng)元表面光滑、立體感強(qiáng)，以此為標(biāo)準(zhǔn)選擇要進(jìn)行封接的細(xì)胞。 封接用微電極由薄壁有芯軟質(zhì)玻璃毛坯二次拉制而成，充灌電極內(nèi)液后電阻為8～12 MΩ。 用微操縱儀操縱記錄電極尖端接近所選神經(jīng)元。 在電極接近細(xì)胞的過(guò)程中，用1 mL注射器從后部給微電極內(nèi)施加正壓，以防止電極尖端在脊髓組織內(nèi)被堵塞。 微電極接觸細(xì)胞時(shí)，會(huì)觀(guān)察到細(xì)胞表面出現(xiàn)一個(gè)小凹，同時(shí)從封接測(cè)試窗口上顯示封接電阻變大。 撤去正壓，并施以一定的負(fù)壓吸引，同時(shí)將鉗制電壓調(diào)至-60 mV，如果封接電阻上升至GΩ水平，一般為2～8 GΩ，說(shuō)明封接成功。 等待約1 min，從微電極尾端給予短促的負(fù)壓吸引，直至細(xì)胞膜被吸破，從而形成全細(xì)胞（wholecell）模式。

　　1.2.3數(shù)據(jù)采集與分析記錄的信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器放大與4 kHz的濾波，由數(shù)據(jù)采樣板進(jìn)行A/D轉(zhuǎn)換，采樣頻率為10～20 kHz， 存貯在計(jì)算機(jī)內(nèi)。 分別在電壓鉗和電流鉗模式下輸入超極化方波刺激，記錄神經(jīng)元膜電位的反應(yīng)情況和刺激誘導(dǎo)出來(lái)的電流。 所得數(shù)據(jù)以表示。［醫(yī)學(xué)教 育網(wǎng) 搜集整理］

　　2.結(jié)果

　　2.1細(xì)胞超極化電流刺激記錄電壓反應(yīng)當(dāng)細(xì)胞接受增幅為-10 pA超極化電流刺激后，在膜電位向靜息水平的復(fù)極過(guò)程中，再次出現(xiàn)明顯的超極化以對(duì)抗膜電位回復(fù)到靜息膜電位。 參考去極化反跳的定義［1］，我們把這個(gè)現(xiàn)象稱(chēng)為“超極化反跳”，隨著刺激強(qiáng)度的增加，超極化反跳的幅值也在增大（圖1）。 幅值的測(cè)量為膜電位超極化的最大值與靜息膜電位之間的差值。 能引起超極化反跳的激活電流范圍為：-40～-70 pA. 大于-70 pA的刺激不會(huì)引起超極化反跳的幅值進(jìn)一步增大。 超極化反跳幅值的最大值為（16.5±3.8） mV。

　　2.2細(xì)胞超極化電壓刺激記錄電流反應(yīng)在同一神經(jīng)元上，增幅為-10 mV超極化電壓刺激能引起快激活、慢失活的外向流，該外向流具有電壓依賴(lài)性（圖2A）。 激活電壓范圍為：-60～-110 mV. 電流的最大值為（45±2.1）pA （n=17），時(shí)程為（475±0.8）ms （n=17）。 圖2B顯示的是該外向流的IV曲線(xiàn)，從曲線(xiàn)可以看出該外向流幅度隨膜電位的超級(jí)化而增大，其翻轉(zhuǎn)電位為-100.8 mV. 圖2C是該外向流的激活曲線(xiàn)，半數(shù)激活電壓為-102 mV.

　　2.3超極化反跳和超極化激活外向流的時(shí)間依賴(lài)性分別在電壓鉗和電流鉗模式下，固定輸入的電流和電壓刺激強(qiáng)度不變，而改變刺激的時(shí)間，分別以25 ms和5 ms的量遞增，發(fā)現(xiàn)超極化反跳和外向流的幅值均沒(méi)有發(fā)生變化（圖3）。 說(shuō)明記錄到的超極化反跳和外向流不具有時(shí)間依賴(lài)性。

　　3.討論

　　以往認(rèn)為神經(jīng)元在靜息狀態(tài)時(shí)，只會(huì)對(duì)引起膜電位去極化的刺激產(chǎn)生反應(yīng)，而沒(méi)有注意到對(duì)于引起膜電位超極化刺激神經(jīng)元會(huì)有何反應(yīng)，忽略了神經(jīng)元處于比靜息膜電位更超極化狀態(tài)下的反應(yīng)性。 在本實(shí)驗(yàn)中，脊髓背角神經(jīng)元在接受超極化刺激后，當(dāng)膜電位處于-110 mV甚至更負(fù)的狀態(tài)下，神經(jīng)元在復(fù)極過(guò)程中出現(xiàn)了再次超極化的現(xiàn)象。 這提示神經(jīng)元在接受引起膜電位超極化的刺激后會(huì)對(duì)刺激發(fā)生反應(yīng)，而且反應(yīng)具有多樣性，包括產(chǎn)生去極化反跳，爆發(fā)動(dòng)作電位和“超極化反跳”，發(fā)生再次超極化。 這兩個(gè)現(xiàn)象具有對(duì)應(yīng)性：兩者的激活條件相同，出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)相同，而且都具有電壓依賴(lài)性。 但是反跳和超極化反跳之間也存在許多不同點(diǎn)：表現(xiàn)方向截然相反。 反跳是膜電位去極化，而超極化反跳是膜電位超極化；反跳在神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域均被記錄到，有關(guān)超極化反跳在此之前的研究報(bào)道較少，并且該現(xiàn)象在本實(shí)驗(yàn)中的發(fā)生率也很低，不到10％。

　　我們參考“去極化反跳”的定義，結(jié)合實(shí)驗(yàn)中記錄到該現(xiàn)象的特點(diǎn)給出了“超極化反跳”的定義。 Burdakov等［6］定義的超極化反跳是指細(xì)胞膜在接受超極化刺激后，膜電位的復(fù)極時(shí)程較長(zhǎng)，并沒(méi)有出現(xiàn)本研究所記錄的復(fù)極過(guò)程中出現(xiàn)的二次超極化現(xiàn)象。 在本研究中，超極化反跳在大鼠脊髓背角膠質(zhì)層神經(jīng)元上表現(xiàn)為接受超極化刺激后，膜電位在復(fù)極前長(zhǎng)時(shí)程的超極化現(xiàn)象，而且記錄到了一個(gè)對(duì)應(yīng)的外向電流。 因此，我們認(rèn)為用“超極化反跳”來(lái)定義這個(gè)現(xiàn)象更確切。 對(duì)膠質(zhì)層神經(jīng)元超極化狀態(tài)下細(xì)胞反應(yīng)特性的研究能揭示感覺(jué)神經(jīng)元功能的復(fù)雜性，為進(jìn)一步探索感覺(jué)信息傳遞機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

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