【摘要】  目的：探討糖皮質(zhì)激素治療嬰幼兒血管瘤的機(jī)理。 方法：對(duì)50例不同組別血管瘤（治療顯效組18例，無效組17例，未治療組15例）及16例正常皮膚標(biāo)本進(jìn)行：①凋亡研究：光鏡及透射電鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化；TUNEL法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的凋亡水平；IHC法檢測(cè)凋亡調(diào)控基因bcl2， cmyc的表達(dá)；②增殖水平研究：IHC法檢測(cè)PCNA. 結(jié)果：①組織形態(tài)學(xué)變化：光鏡下各組均無明顯炎癥及壞死征象，透射電鏡觀察顯效組有較多VEC凋亡征象。 ②VEC增殖及凋亡：顯效組VEC的凋亡水平顯著高于無效組、未治療組及正常皮膚組（TUNEL： 47.86±3.14， 22.05±3.93， 19.20±2.82， 35.51±3.81， P<0.01）， 而增殖水平明顯低于上述三組（PCNA： 10.25±3.89， 44.33±5.01， 56.32±4.12， 17.91±3.76， P<0.01）。 ③凋亡調(diào)控情況：顯效組bcl2表達(dá)顯著低于無效組和未治療組（21.28±4.70， 49.96±5.33， 52.51±7.69， P<0.01）；cmyc表達(dá)也明顯低于后兩組（25.20±5.01， 51.81±5.68， 56.28±6.92， P<0.01）。 結(jié)論：① 糖皮質(zhì)激素可能通過誘導(dǎo)VEC凋亡及抑制其增殖而促進(jìn)血管瘤消退。 ② 糖皮質(zhì)激素對(duì)VEC凋亡的影響可能與其下調(diào)bcl2和cmyc的表達(dá)水平有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】  血管瘤， 血管內(nèi)皮細(xì)胞；糖皮質(zhì)激素；增殖， 凋亡

　　0引言

　　血管瘤（不包括血管畸形）是小兒最常見的腫瘤，絕大多數(shù)為良性［1］。 糖皮質(zhì)激素治療是目前公認(rèn)的首選方法［2-3］。 但其治療機(jī)理目前并不十分清楚，且在臨床上，仍有部分血管瘤療效不明顯。 本文通過檢測(cè)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelia cell，VEC）的增殖、凋亡以及凋亡調(diào)控指標(biāo)，結(jié)合光鏡及電鏡下組織形態(tài)學(xué)變化，初步探討激素治療血管瘤的機(jī)理，為提高臨床療效提供思路。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　199906/200405手術(shù)切除的草莓狀血管瘤標(biāo)本50例及正常皮膚標(biāo)本16例，血管瘤標(biāo)本取自4月到2歲患者，其中未治療組15例，治療顯效組18例，無效組17例，男女比例為1∶2. 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（寶靈曼公司）；鼠抗人PCNA單克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；cmyc及bcl2試劑盒（福州邁新公司）；SP試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1免疫組化染色用過氧化物酶抗過氧化物酶法檢測(cè)

　　VEC的增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）水平及cmyc和bcl2的表達(dá)水平。 PCNA，cmyc以胞核染色棕色者為陽(yáng)性，而bcl2以胞漿中見棕色顆粒者為陽(yáng)性。 光鏡400倍下不同視野隨機(jī)觀察300個(gè)VEC，計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，記為陽(yáng)性表達(dá)率（positive rate）。

　　1.2.2凋亡細(xì)胞的原位檢測(cè)

　　采用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TdTmediated dUTP nick end labeling， TUENL），原位標(biāo)記凋亡細(xì)胞核中的DNA片段3′OH末端，顯示未治療組、治療顯效組和治療無效組及正常對(duì)照組VEC的凋亡。 檢測(cè)方法按寶靈曼公司試劑盒說明書進(jìn)行，以PBS代替生物素化的dUTP作為陰性對(duì)照。 光鏡400倍下不同視野隨機(jī)觀察300個(gè)VEC，均以胞核染色棕色者為陽(yáng)性，計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)。

　　1.2.3光鏡下組織形態(tài)學(xué)標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)H.E染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察其組織學(xué)特點(diǎn)、VEC增殖情況及血管壁結(jié)構(gòu)完整性。

　　1.2.4透射電鏡觀察顯效組1例（6 mo，女）細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化常規(guī)無菌術(shù)切除血管瘤瘤體，修去脂肪組織后切成小塊，用2.5 g/L戊二醛固定，按常規(guī)方法制備半薄切片、超薄切片，H600型透射電子顯微鏡觀察、攝片。 取同齡小兒擇期手術(shù)中所棄正常皮膚作為對(duì)照。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料用x±s表示，組間均數(shù)比較經(jīng)SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和q檢驗(yàn)，P<0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2結(jié)果

　　2.1光鏡下組織形態(tài)學(xué)與正常皮膚組相比，顯效組18例血管瘤在鏡下以脂肪組織及少量纖維組織為主，VEC無明顯增殖現(xiàn)象，未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、血管壁塌陷、管腔堵塞及VEC脫落等組織結(jié)構(gòu)破壞征象；未治療組15例以及無效組17例在鏡下以大量增生的血管為主，VEC增殖活躍，未見前述組織結(jié)構(gòu)破壞征象（圖1A~D）。

　　2.2透射電子顯微鏡觀察與正常皮膚組織相比，顯效組血管瘤組織中許多VEC呈典型的凋亡形態(tài)變化，染色質(zhì)固縮聚于核膜下，境界分明，有完整的核膜包繞，細(xì)胞漿濃縮，可見線粒體輕度腫脹等而基本未見到明顯的VEC壞死征象（圖2A~D）。

　　A： 正常皮膚； B： 顯效組血管瘤中凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞。

　　2.3VEC增殖及凋亡情況于光學(xué)顯微鏡下按上述標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示顯效組VEC的凋亡水平高于無效組、未治療組及正常皮膚組（P<0.01），而增殖水平低于上述三組（P<0.01）。 bcl2：無效組和未治療組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 其余各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 cmyc：無效組和未治療組，顯效組和正常皮膚組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，余各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。表1VEC凋亡指數(shù)及各指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)（略）

　　3討論

　　血管瘤是小兒最常見的腫瘤，多數(shù)能自然、緩慢地消退。 但某些生長(zhǎng)在顏面、頸部等特殊部位或增長(zhǎng)特別迅速者可影響正常器官功能或引起潰瘍、出血和疼痛等并發(fā)癥，需積極治療。 臨床上使用糖皮質(zhì)激素治療血管瘤已有多年，主要有強(qiáng)的松口服或縮丙酮確炎舒松及倍他米松［2］瘤體內(nèi)注射等途徑。 和激光、冷凍、同位素敷帖及硬化劑注射等方法相比，激素治療具有在早期無局部紅、腫等炎癥表現(xiàn)，后期血管瘤消退后不殘留疤痕，亦無色素沉著等優(yōu)點(diǎn)，這一點(diǎn)與血管瘤自然消退過程頗為類似。 近年研究顯示，VEC增殖—凋亡平衡的變化可能在這一自然過程中起著重要作用：增生期VEC增殖水平高于凋亡，血管瘤快速增長(zhǎng)；隨年齡增長(zhǎng)，VEC增殖水平漸下降而凋亡水平上升，VEC堆積逐漸減少，血管瘤緩慢消退［4-7］。 此外，有研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等發(fā)生凋亡［8］，提示其誘導(dǎo)VEC凋亡的可能性存在。 據(jù)此推測(cè)，糖皮質(zhì)激素也可能通過誘導(dǎo)VEC凋亡從而促進(jìn)血管瘤“自然”地消退。 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中進(jìn)行了VEC凋亡和增殖方面的研究。 首先，檢測(cè)了各組標(biāo)本的TUNEL水平和PCNA表達(dá)水平。 TUNEL是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種敏感性和特異性均較高的方法，而PCNA是反映細(xì)胞增殖情況的良好指標(biāo)。 結(jié)果顯示，顯效組血管瘤VEC的TUNEL水平顯著高于未治療組、無效組及正常皮膚組，而PCNA水平低于上述三組，即顯效組的凋亡水平高而增殖水平低，提示糖皮質(zhì)激素注射治療能促進(jìn)VEC凋亡同時(shí)抑制其增殖，從而促使血管瘤消退。

　　在組織形態(tài)學(xué)觀察中，光鏡下發(fā)現(xiàn)顯效組18例VEC明顯減少，且增殖不活躍，代之為脂肪組織及少量纖維組織，未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、血管壁塌陷及VEC脫落等炎癥及壞死征象；透射電鏡下可見較多凋亡VEC，而基本未見VEC壞死征象。 從而進(jìn)一步證實(shí)，糖皮質(zhì)激素治療后血管瘤的萎縮緣于大量的VEC發(fā)生了凋亡而非壞死［9］，所以不伴炎癥及疤痕增生、色素沉著等并發(fā)癥。

　　為探討激素對(duì)VEC凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)中還檢測(cè)了常見的凋亡調(diào)控基因bcl2及cmyc在各組中的表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與其高凋亡率恰好相反，顯效組血管瘤VEC的bcl2表達(dá)水平明顯低于其他各組，提示糖皮質(zhì)激素對(duì)血管瘤VEC凋亡的誘導(dǎo)作用可能與bcl2表達(dá)水平下調(diào)，對(duì)凋亡的抑制作用減弱有關(guān)。 在我們的實(shí)驗(yàn)中，顯效組血管瘤VEC的cmyc表達(dá)水平明顯低于其他三組，與bcl2變化趨勢(shì)相似，提示cmyc在VEC中可能也起著抑制凋亡的作用，且這一作用可能因受到糖皮質(zhì)激素的下調(diào)而減弱。 綜上所述，糖皮質(zhì)激素可能通過下調(diào)血管瘤VEC的bcl2及cmyc的表達(dá)，誘導(dǎo)VEC凋亡，從而促進(jìn)血管瘤消退。 這種下調(diào)的具體機(jī)制目前尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

　　我們發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可能通過某些調(diào)節(jié)機(jī)制下調(diào)血管瘤VEC bcl2和cmyc的表達(dá)，使VEC凋亡增加而增殖受到抑制，從而促進(jìn)血管瘤消退，而對(duì)此調(diào)節(jié)的失敗可能是治療無效的原因之一。 對(duì)于這部分病例，能否找到一種有效地下調(diào)其bcl2及cmyc表達(dá)的方法，如利用反義核酸特異性地阻斷其表達(dá)，從而提高糖皮質(zhì)激素治療的療效，有待進(jìn)一步探討。

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