[醫(yī)學(xué)免疫學(xué)]測定蛋白樣品中某種分子量的蛋白選用最佳的方法是
選項:
A.免疫PCR
B.免疫沉淀法
C.免疫印跡試驗(Western blotting)
D.斑點雜交
E.Southem blotting
答案：
C
解析：
答復(fù)：本題選C。
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。
一、原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
二、操作步驟
�。ㄒ唬┑鞍踪|(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min.然后4℃，13，000g離心15min.取上清液作為樣品。
（二）電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE.
�。ㄈ┺D(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）
1、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次。
2、膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min. 3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源，恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對比。
�。ㄋ模┟庖叻磻�(yīng)：1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。
2、加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2hr. 3、棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。
5、棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。
6、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩(wěn)搖動，室溫2hr. 7、棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。
8、加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。
三、注意事項
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實驗確定最佳條件。
2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2. 3、DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細(xì)。