抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用：

免疫動物

（1）抗原：免疫動物是制備抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、細菌或者其他蛋白質(zhì)抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必須與大分子載體連接?？乖挠昧恳暱乖N類及動物而異，—次注射小鼠可以少至幾個微克，免、羊甚至更大的動物每次注射的量就相應(yīng)增加，從幾百μg/次至幾mg/次。

〔2）佐劑及乳化：佐劑可以幫助抗原在注射部位緩慢釋放，以增加免疫刺激的效果。佐劑有完全和不完全佐劑之分。完全佐劑加有滅活的分枝桿菌（如卡介苗）或棒狀桿菌。福氏佐劑可從試劑公司購買，也可用羊毛脂和石蠟油按1：2—4混合自行制備。佐劑與抗原按1：1的比例混合乳化為均勻的乳液，放置后不會發(fā)生油水分離。

（3）免疫動物：常用于制備抗血清的動物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生產(chǎn)可用動物羊、馬等，動物接受免疫的乳液量小鼠為1.0—2.0mL，家兔為2—4mL.抗原免疫動物的途徑取決于動物種類、抗原特性和是否使用佐劑。腹腔注射（i.p），肌肉注射（i.m），皮內(nèi)注射（i.d.）和皮下注射（s.c.）適合于任何抗原，這些途徑主要刺激局部淋巴結(jié)發(fā)生免疫應(yīng)答，初次免疫和免疫加強注射均可使用。靜脈注射（i.v.）則只適合于可溶性抗原及分散的單細胞懸液，且不能使用佐劑，其誘發(fā)的免疫應(yīng)答主要發(fā)生在脾臟。此外，在單克隆抗體制備時，亦可用脾臟直接注射或體外免疫方法，尤其對微量抗原比較實用。體外免疫方法也常用于人源單克隆抗體的制備。體外免疫時將脾細胞或外周血淋巴細胞（包括B細胞，T細胞及抗原遞呈細胞）與抗原一起作體外培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細胞融合。初次免疫后要經(jīng)過2—3次以上的免疫加強以保證能形成較高水平的IgC抗體。兩次免疫注射之間的時間間隔，一般3—4周比較適合大部分動物，小動物可間隔10—14d，大動物則在2月左右。在免疫加強最后一次注射后的一周內(nèi)采集抗血清，可獲得高水平的抗體。

抗血清的純化與保存

（1）采血：加強免疫的動物2—3次后，可通過耳靜脈或眼球（小鼠）采血，進行抗血清效價測定。當(dāng)效價達到理想的高度后，可以采血。采血方式可以從心臟直接取血，也可通過動脈放血。待血液凝固后用針筒或吸管吸取血清。

（2）抗血清的純化與保存：除抗體外血清中含有多種其他蛋白成分。為了避免這些蛋白質(zhì)干擾抗體（免疫球蛋白）標(biāo)記反應(yīng)和抗原抗體反應(yīng)，抗血清可經(jīng)過純化以獲得單一的機體（常為IgG）組分。常用的純化IgG的方法為飽和硫酸胺鹽析和層析法。蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度的溶液中，其溶解度不一樣，鹽離子干擾蛋白質(zhì)和水分子間氫鍵形成，因為水—鹽結(jié)合比水—蛋白質(zhì)結(jié)合更穩(wěn)定，蛋白質(zhì)即可從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)分子越大，沉淀時所需鹽離子濃度越低。免疫球蛋白（Mr1.5×105）比血清中主要蛋白質(zhì)白蛋白（Mr6.7×104）的分子大得多，抗體在30%—50%飽和度的硫酸鹽中析出，而白蛋白需在70%—80%飽和度才析出，因此常用33%飽和度的硫酸胺純化血清中的IgG.鹽析時為了減少抗體變性，需在4℃進行，同時用pH8.0緩沖液稀釋抗血清，以減少蛋白濃度過高而發(fā)生共沉淀。銨鹽的溶解度不隨溫度變化而明顯改變，0℃和25℃僅差3%，而鈉鹽則相差5倍，因此常在低溫沉淀時用銨鹽，室溫沉淀用鈉鹽。銨鹽對抗體的標(biāo)記反應(yīng)（如FITC和biotin標(biāo)記時）有一定的干擾作用。

鹽析法只能部分純化抗體，更高純度的抗體制劑可用層析法制備。IgM五聚體相對分子質(zhì)量達9.7×10，比血清中任何其他蛋白都大，用分子篩層析很容易將其純化。IgG在PH8.0時帶負電荷，能與DEAE纖維素上的陽離子結(jié)合，因此可用離子交換層析來純化IgG.IgG純化最常用的方法為親和層析。IgG與葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白具合高度的親和性，可用這兩種蛋白質(zhì)交聯(lián)親和層析柱將IgG純化。大部分IgG與蛋白A結(jié)合PH為8—9，洗脫PH為2—4；而與蛋白G的結(jié)合PH為5—7，洗脫PH為9—10.C蛋白更適合于IgG的純化，不但反應(yīng)條件為溫和的弱酸性或弱堿性，并且與IgG的結(jié)合力高于A蛋白。G蛋自能與大部分動物種類的IgG結(jié)合，而A蛋白對小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、馬和綿羊IgG結(jié)合力弱或不能結(jié)合G蛋白和A蛋白均不能與雞IgG結(jié)合。

抗血清或純化的抗體在低溫保存可維持活性數(shù)年，反復(fù)凍融使抗體很快失活，被細菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀釋的抗血清加入防腐劑疊氮化鈉和保護劑如BSA等可于4℃保存。長期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于50%飽和硫酸銨中4℃保存，還可以冷凍干燥保存。

抗血清的特性鑒定

根據(jù)不同目的制備的抗血清，對其中所含抗體的濃度，特異性及免疫球蛋白種類的要求也不一樣。為了獲得質(zhì)量和數(shù)量上合符要求的抗血清，在收集動物血清前必須對免疫效果進行檢測，對收獲后的抗血清也必須對—些參數(shù)進行分析，如效價、親和力及交叉反應(yīng)等。根據(jù)不同的抗原性質(zhì)選用合適的檢測方法。最常用的為免疫沉淀，ELISA，放射免疫等。

效價又稱滴度（titer），是常用于表達抗血清中特異性抗體相對含量的—個半定量指標(biāo)，即在給定的條件下，結(jié)合—定量抗原的抗血清的稀釋度?？寡褰?jīng)一系列稀釋后（如倍比稀釋）與定量的抗原反應(yīng)，以能檢測抗血清最大稀釋倍數(shù)即為該抗血清的效價。不同的檢測方法測定同一種抗血清的效價，靈敏度不一樣，抗血清的效價也不一樣，如沉淀反應(yīng)（瓊脂雙擴散）與ELISA二者的效價相差甚大，后者遠高于前者。放射免疫分析（RIA）常用于標(biāo)記小分子抗原來檢測抗血清的效價。

親和力（affinity）表示抗血清與相應(yīng)抗原的結(jié)合強度，是描述抗體持異性的重要指標(biāo)，

常用親和常數(shù)K表示。親和常數(shù)K與抗原抗體反應(yīng)的平衡常數(shù)有關(guān)：

抗體特異性與交叉反應(yīng)：抗體是特異的。只與相應(yīng)抗原反應(yīng)。實際制備的抗體卻常有非特異性反應(yīng)，這是因為抗原不純造成的。多組分抗原之間存在共同的抗原決定簇，或者兩個抗原決定簇結(jié)構(gòu)類似能與同一抗體結(jié)合，均可出現(xiàn)抗體與異源抗原的交叉反應(yīng)。用瓊脂雙擴散能簡便直觀地反映不同抗原與同一抗血清，或不同抗血清與同一抗原的交叉反應(yīng)。

單克隆抗體的制備

原理1：單克隆抗體（MAb）與抗血清（又稱多克隆抗體，PAb）最主要的區(qū)別是MAb為單一種B細胞克隆所產(chǎn)生的一種均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B細胞克隆的標(biāo)志，是一種獨特型的抗體，它的特異性是針對一個抗原決定簇的。制備單克隆抗體不能用化學(xué)分離的方法從多克隆抗體中去分離純化得到它，而是用分離產(chǎn)生抗體的B細胞克隆的方法得到它。為了使B細胞克隆能在體外人工培養(yǎng)下長期存活并產(chǎn)生完全均一的MAb，G.KÖ；hler合Milstein于1975年創(chuàng)立了雜交瘤方法。所以制備單克隆抗體的技術(shù)又稱雜交瘤技術(shù)（hybredomatechnique）。

雜交瘤技術(shù)的基本原理是用分泌抗體但不能長期培養(yǎng)的B細胞與能在體外長期培養(yǎng)并可低溫保存的腫瘤細胞進行雜交。篩選得到的雜交瘤細胞應(yīng)該是既能分泌抗體又有瘤細胞的特性，可長期傳代培養(yǎng)，又可在液氮中保存的細胞。把這些細胞單克隆化，用單克隆化的雜交瘤細胞進行單克隆抗體的生產(chǎn)。

原理：最常用的單克隆抗體是小鼠的單抗，此外也有大鼠的和人源的單抗。人源單抗制備比較復(fù)雜。小鼠單抗的制備通常是使用Balb/c小鼠的B細胞和它的骨髓瘤細胞。大鼠的單抗制備通常用Lou/c大鼠及其骨髓瘤和Y3/AO大鼠及其骨髓瘤細胞。B細胞是從免疫動物的脾臟中分離出來的。動物免疫方法與抗血清制備相同，只是在制備脾臟前3d必須進行一次靜脈加強注射以保證得到的B細胞有旺盛的分泌抗體的活性。骨髓瘤細胞有許多細胞株是經(jīng)過誘變和篩選得到的缺陷型。篩選的標(biāo)準(zhǔn)是①瘤細胞本身不產(chǎn)生抗體或者產(chǎn)生抗體的某種鏈，但不能分泌；②是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型。因為這種缺陷型的瘤細胞正常的核酸合成途徑被氨基喋吟（aminopterin）阻斷后，由于缺失這些酶，即使補充它的底物次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T），核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，結(jié)果導(dǎo)致瘤細胞死亡（圖7—2）。而雜交瘤細胞因帶有B細胞的全套基因，在HAT存在的條件下借助于HGPRT和TK的作用通過替代的核酸合成途徑能正常合成DNA和RNA.所以雜交瘤能正常地生長繁殖而被選擇出來。未被融合的游離的B細胞只能存活3d而后自行死亡。這就是用HAT培養(yǎng)基進行選擇的原理。

細胞雜交與選擇培養(yǎng)

（1）融合：細胞雜交之前，要分別準(zhǔn)備好脾臟的B細胞懸液和小鼠骨髓瘤細胞（如SP2/0—Agl4細胞株）。免疫后的小鼠脾臟在無菌條件下破碎，將B細胞懸浮在沒有血清的培養(yǎng)液中（通常使用RPMIl640商品配制），并洗滌3次去掉小鼠的血清。SP2/0細胞是用加有10%胎?；蛐∨Ｑ迮囵B(yǎng)的，每天更換新鮮培養(yǎng)液使成為對數(shù)分裂期生長旺盛的細胞。細胞用RPMIl640洗滌2—3次，把兩種細胞合并在同—試管中，用50%的聚乙二醇（相對分子質(zhì)量為1000—1500）作為融合劑，在37℃條件下融合l—2min.然后用1640培養(yǎng)液緩慢稀釋，然后除去PEG，將細胞分散至HAT選擇培養(yǎng)板中。電融合方法也可用于單克隆抗體制備，雖融合率較高，但一次融合的細胞數(shù)少，且需專門設(shè)備，故限制了其廣泛使用。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例在5：1—10：1均可獲得滿意結(jié)果，每次融合細胞數(shù)量在10—10較為合適。融合后的細胞在40或96孔板上的HAT培養(yǎng)液（RPMIl640含10%—20%胎?；蛐∨Ｑ搴虷AT）中37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。融合后的細胞懸液中只有脾細胞和骨髓瘤細胞形成的雜交瘤細胞能在HAT培養(yǎng)基中生長，其他形式的融合細胞均不能生長。未融合的細胞也不能在HAT培養(yǎng)液中生存。

在融合后的細胞培養(yǎng)過程中，飼養(yǎng)細胞（feedercell）有助于雜交瘤細胞的生長。飼養(yǎng)細胞可用同種動物的腹腔細胞或胸腹細胞。腹腔細胞中的吞噬細胞能清除死亡細胞碎片。使背景更為清潔“干凈”。同時飼養(yǎng)細胞分泌的細胞因子或活性物質(zhì)有助于雜交瘤細胞的生長?，F(xiàn)有商品“雜交瘤細胞生長因子”可用于替代飼養(yǎng)細胞。

（2）陽性雜交瘤細胞的篩選與單克降化：雜交細胞經(jīng)約10—14d培養(yǎng)后，形成可用的細胞集落（克?。＝?jīng)過幾次更換培養(yǎng)液（HT培養(yǎng)液）后進行抗體活性檢測。常用的篩選槍測方法是ELISA和凝集試驗，前者常用于可溶性抗原，后者適用于細胞、細菌等表面抗原。此外，Dot－ELISA、免疫印跡及免疫熒光試驗均可用于雜交瘤細胞的篩選。

使許多細胞克隆混合生長的細胞分離為單個的細胞克隆的過程稱克隆化（colonization）最常用的單克隆化方法是有限稀釋法（limiteddilution），即將混合細胞經(jīng)稀釋后分裝于培養(yǎng)板上，使培養(yǎng)板的大部分孔中只出現(xiàn)一個細胞。為了確?？贵w分泌細胞來源于單個細胞，克隆化過程可重復(fù)進行，稱為亞克隆化（subclonization）。除有限稀釋法外，熒光激活細胞分揀法（FACS）也用于雜交瘤細胞的克隆化過程。

單克隆抗體的擴大生產(chǎn)

產(chǎn)生特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞株應(yīng)立即擴大培養(yǎng)，以獲得足夠的細胞用于保存和生產(chǎn)可供應(yīng)用的抗體。生產(chǎn)大量單克隆抗體的方法目前常用的有3種：小鼠腹水制備、大瓶培養(yǎng)和中空纖維反應(yīng)器，前者多用于實驗室制備，后二者適應(yīng)于工廠化生產(chǎn)。

腹水制備：雜交骨髓瘤細胞在腹腔中定植，并產(chǎn)生大量腹水。選用與單克隆抗體制備所用相同的動物品系或者含有相同基因的Fl代雜交品系。雜交F1代品系更適合于腹水制備，如果用異源動物制備腹水時可選用無MHC限制性的裸鼠。用小鼠制備腹水時，先用礦物油或Pristane致敏，以抑制其免疫功能，利于腹水的形成。腹腔注射10—10個雜交瘤細胞，經(jīng)過7—10d后形成腹水。每只小鼠可獲得3—5mL腹水，每mL含IgG抗體可達5—10mg.腹水中含有較多的雜蛋白和非特異性IgG，并且含有許多蛋白酶，易使抗體失活，因此腹水收集后應(yīng)盡快純化，以防止降解。

大瓶培養(yǎng)：采用1000mL或更大的搖瓶培養(yǎng)。大瓶培養(yǎng)上清體積大，但抗體濃度低，給抗體純化帶來很大困難，消耗人力和培養(yǎng)液，增加生產(chǎn)成本。

中空纖維反應(yīng)器：是比較經(jīng)濟的單克隆抗體生產(chǎn)方法。該裝置由具有半透膜性質(zhì)的成束的微孔纖維組成，雜交瘤細胞位于纖維外部的小量培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液在纖維的微孔中循環(huán)，供給營養(yǎng)和帶走廢物，抗體大分子和小分子化合物被隔開。高密度的雜交瘤細胞能在此系統(tǒng)中維持?jǐn)?shù)月，每天可產(chǎn)生數(shù)百毫克的抗體，抗體濃度高，體積小易于純化。

胎（?。┡Ｑ逡恢笔羌毎囵B(yǎng)所必須的，在單克隆抗體生產(chǎn)過程中培養(yǎng)液中的血清蛋白使抗體的純化增加了困難，近年開發(fā)的無血清培養(yǎng)技術(shù)已逐漸用于單克隆抗體的生產(chǎn)中。

人單克隆抗體的制備

小鼠的單克隆抗體蛋白應(yīng)用于人體后，作為抗原能引起人的免疫應(yīng)答，大大降低其生物活性，并可能導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)。因此人源單克隆抗體在臨床治療上有廣泛應(yīng)用前景，引起人們的普遍興趣。但是人單克隆抗體制備存在許多技術(shù)上和倫理上的障礙，如人雜交瘤細胞系不穩(wěn)定，有些抗原不能對人進行人工免疫，人B細胞只能從外周血中分離而無法從脾臟取得等。盡管如此，一些人源單克隆抗體已經(jīng)獲得，技術(shù)上也在逐步完善起來。

人的瘤細胞株U—266常用來與人外周血B細胞融合以獲得人源單克隆抗體。另一些淋巴母細胞抹（LCL）則來源于EB病毒轉(zhuǎn)化的淋巴細胞，如GMl500，W1—L2和ARH77等也用于雜交瘤細胞的制備。這些細胞系表現(xiàn)ED病毒核抗原（EBNA）陽性，且形成的雜交瘤細胞抗體的分泌水平不高。

獲得人單克隆抗體的另一方法是用EBV直接轉(zhuǎn)化某些抗體分泌細胞，使之成為“不死”的細胞在體外培養(yǎng)。EBV感染人B細胞后，病毒基因插入人B細胞基因組中，有1%的細胞轉(zhuǎn)化為“不死”的細胞。B細胞轉(zhuǎn)化可通過“病毒驅(qū)動”和“細胞驅(qū)動”兩種方法獲得。前者是將B細胞與分泌EBV的B95—8細胞系一同培養(yǎng)，后者則是與EBNA陽性的LCL細胞一同培養(yǎng)。“細胞驅(qū)動”轉(zhuǎn)化的B細胞比較穩(wěn)定，抗體分泌能力也較強。

人淋巴母細胞系和人雜交瘤細胞較難獲得，人單克隆抗體也可以通過異源雜文的辦法制備，即將EBV轉(zhuǎn)化的B細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，將獲得的異源雜交瘤細胞再與免疫后的B細胞融合，得到人單克隆抗體分泌細胞，不產(chǎn)生自身免疫球蛋白，EBVA也是陰性。

基因工程抗體的制備

抗體的化學(xué)修飾：

抗體Fc段用雙功能連接劑與熒光素，同位素，酶，發(fā)光化合物，稀土元素以及藥物，毒素等連接后，并不影響其Fab功能區(qū)與特異性抗原結(jié)合。根據(jù)交聯(lián)物的性質(zhì)不同，標(biāo)記的抗體可用作診斷試劑，也可作為藥物的定向載體，引導(dǎo)藥物或毒素到達抗原存在部位使藥物或使毒素發(fā)揮更有效的作用，即俗稱“生物導(dǎo)彈”。從而減少藥物、毒素、同位素、酶在腫瘤治療過程中引起嚴(yán)重的副作用，大大提高治療腫瘤的效果。

許多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，紅豆毒素等均為蛋白質(zhì)或糖蛋白，可用雙功能劑與抗體相連；嗎啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶C等含有羧基能用碳二亞胺（EDC），混合酸酐法與抗體的氨基形成酰胺鍵；同樣，含脂肪胺的藥物如慶大雷素，阿霉素在水溶性EDC的作用下與抗體的羧基連接；而含芳香胺的藥物則先在低溫下與亞硝酸作用形成重氮化合物，再與抗體分子上的酪氨酸或組氨酸殘基形成偶氮鍵?？傊ㄟ^抗體的化學(xué)修飾把抗體的特異性用到定向給藥和定位檢測上。

抗體基因文庫

抗體基因文庫（antibodyrecombinationlibrary）是將不同的重鏈和輕鏈基因隨機組合，克隆到合適的表達載體中，在原核細胞表達不同的抗體，形成一個抗體庫，從這個抗體庫中，用抗原可以篩選到相應(yīng)的抗體基因?？贵w基因來源于雜交瘤細胞或動物B細胞（免疫或未免疫）的DNA和mRNA.

用質(zhì)粒作為抗體文庫的載體，雖然也可能表達有活性的抗體分子或片段，但由線狀噬菌體表達更為方便有效。M13、fd、F1等噬菌體的外殼蛋白由5種蛋白組成：pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ。每種含量不一，其中pⅧ含量最多，每個噬菌體有2700個pⅧ亞基，其余4種蛋白僅5個拷貝。增加噬菌體外殼蛋白的長度并不影響噬菌體的裝配，抗體以融合蛋白的形式表達于噬菌體表面。噬菌體表達質(zhì)粒常用的有fd－CAT1、fd－tet－DOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等?？贵w融合蛋白構(gòu)建多用pⅢ和pⅧ，pⅧ拷貝數(shù)高，低親和力的抗體蛋白容易篩選出來。

在噬菌體表達抗體時，常常不表達完整的抗體分子，（因為CH2上不能進行糖基化）。根據(jù)不同的引物得到重鏈的VH或VHCH1區(qū)，輕鏈的VL或VLCL區(qū)。VL和VH兩個片段用一短肽作連接片段，形成單鏈可變區(qū)（single－chainfragmentvariable，scFv）；VHCH1和VLCL兩片段則形成Fab片段。另外，單獨的VH和VL也能結(jié)合抗原，如果二者形成同源或異源二聚體（dAb），則穩(wěn)定性和親和性明顯提高（圖7—4）。此外在抗體片段DNA末端加上一些功能蛋白（如堿性磷酸酶和蛋白毒素）的基因，則表達的抗體就帶有一定生物活性功能片段，可用于檢測或治療。如果在抗體基因末端加上終止子（TAG）則表達的抗體片段是可溶性的，而不是結(jié)合在噬菌體表面。

用特異性抗原免疫的動物B細胞構(gòu)建抗體的噬菌體文庫，抗體親和性高，用與免疫抗原不同的抗原篩選得到的抗體親和性普遍較低?？捎媚M天然體細胞突變的方法來提高親和力。如混雜重組法，即將己獲得的輕鏈或重鏈的V片段切下，再克隆至隨機的文庫中的V區(qū)構(gòu)成二級文庫，使H鏈和L鏈混雜，可以使抗體片段的親和性提高。利用PCR錯配將隨機突變引人至抗體的抗原結(jié)合區(qū)，也能提高對抗原的親和力。先用低親和力的載體在噬菌體的PⅧ表達，篩選后、將抗體基因片段PCR擴增轉(zhuǎn)至PⅢ上表達，可獲得高親和力的抗體片段。

抗體基因文庫有兩個優(yōu)點，一是從不適合進行人工免疫的物種獲得單克隆抗體，如人源單克隆抗體；二是可快速方便獲得單克隆抗體。

抗體基因的改造

將鼠源抗體的V區(qū)基因與人源抗體C區(qū)基因重組，獲得的嵌合抗體（chimericalantibody），可保留鼠抗體對抗原的高親和性，又減弱鼠源抗體對人的免疫原性，提高治療性抗體的效果。

重組的嵌合抗體基因轉(zhuǎn)化骨髓瘤細胞或中國地鼠卵細胞（CH0），可在其中表達。為了進一步地消除鼠抗體V區(qū)框架區(qū)（FW）的異源性，可實行CDR移植（CDRgrafting），以獲得與鼠FW類似的人FW結(jié)構(gòu)的嵌合抗體。

噬菌體表達的抗體僅含V區(qū)（scFv）或Fab片段，缺乏Fc區(qū)，使抗體的穩(wěn)定性下降，半衰期縮短，與Fc受體結(jié)合功能也消失。因此在抗體功能片段的末端連接A蛋白、酶、細胞因子、CD4和毒素等分子，既可增加抗體片段的穩(wěn)定性，又可發(fā)揮某些生物學(xué)活性功能。

用抗體基因工程方法獲得的抗體與效應(yīng)分子交聯(lián)物比用化學(xué)交聯(lián)法具有優(yōu)點：可以大量生產(chǎn)，不會因修飾作用影響抗體及效應(yīng)分子的活性，效應(yīng)分子還可根據(jù)需要進行改造。

此外在抗體片段的末端連接一段特異的雙親性螺旋（amphiphilichelixes）結(jié)構(gòu)，如亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（leucinezipper），可使單價的scFv或Fab片段在體內(nèi)或體外形成穩(wěn)定的雙分子聚合體，從而提高抗體片段的親和力。此法也可用于制備雙特異性抗體。

基因工程抗體在真核細胞中的表達

噬菌體表達的抗體片段常常是在原核細胞（E.coli）中完成。原核系統(tǒng)表達抗體片段產(chǎn)量

高，成本低，快速易于操作。但抗體片段在原核表達系統(tǒng)中不能進行CH2糖基化，從而影響抗體的活性。因此重組抗體基因片段可轉(zhuǎn)移至適合的骨髓瘤細胞系或哺乳動物細胞系（如CHO），甚至于植物細胞中表達，可以得到與淋巴細胞表達相同的抗體分子。免疫球蛋白IgA的重鏈和輕鏈及分泌片基因可以分別轉(zhuǎn)化不同的植株，將表達這些蛋白的植株進行有性雜交，在雜交后代中可以裝配成完整的IgA雙分子。以植物作為生物反應(yīng)器進行抗體的表達已有許多成功的研究報道，與動物細胞相比更為經(jīng)濟，具有廣泛的應(yīng)用前景。

抗體催化的原理

1986年，由P.G.schultz和R.A.Lerner分別領(lǐng)導(dǎo)的兩個小組同時證明抗體具有催化活性。針對一個四面體帶電荷的磷酸酯半抗原產(chǎn)生的抗體，能有選擇性地催化相應(yīng)的碳酸脂和羧酸脂的水解反應(yīng)。他們將這種有催化活性的抗體稱為催化性抗體（catalyticantibody），又稱抗體酶（abozyme）。催化抗體的作用取決于底物分子水解時的轉(zhuǎn)換態(tài)（transitionstate）（圖7—5）。轉(zhuǎn)換態(tài)的分子結(jié)構(gòu)是分子活化后的一種結(jié)構(gòu)狀態(tài)，處于轉(zhuǎn)換態(tài)的分子具有最高的活化能，分子表現(xiàn)極性。處于這種狀態(tài)的分子也是最不穩(wěn)定的，能與這種分子結(jié)合的酶或者抗體會使某些化學(xué)鍵發(fā)生斷裂（如酯鍵，碳鍵，胺鍵等）起到酶解作用。可見抗體酶的作用與天然的蛋白質(zhì)酶非常相似。抗體酶也表現(xiàn)出對底物的專一性，對立體結(jié)構(gòu)的專一性。在飽和動力學(xué)與競爭性抑制方面都與常規(guī)酶相似。所以抗體酶的發(fā)現(xiàn)打破了只有常規(guī)酶才有的分子識別和加速催化反應(yīng)的傳統(tǒng)概念，為酶工程學(xué)開創(chuàng)了新的領(lǐng)域。

抗體催化的化學(xué)反應(yīng)

由抗體催化的化學(xué)反應(yīng)特異性高于酶，但催化速率低于常規(guī)的酶，只有l(wèi)0—10倍。但有一些未發(fā)現(xiàn)催化劑的反應(yīng)，如Diels—Alder反應(yīng)也能被抗體催化。常規(guī)酶一般不能催化胺鍵水解，抗體酶能使胺鍵水解的速度增加25萬倍。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)和證明的由抗體催化的化學(xué)反應(yīng)不下40種。

催化性抗體的制備

抗體酶是抗原決定簇處于轉(zhuǎn)換態(tài)結(jié)構(gòu)的抗體。因為轉(zhuǎn)換態(tài)分子極不穩(wěn)定無法制備抗體，所以催化性抗體的獲得主要是通過設(shè)計穩(wěn)定的轉(zhuǎn)換態(tài)的類似物作為半抗原，與載體蛋白交聯(lián)后，免疫動物，獲得針對半抗原的抗體，從中篩選具有催化活性的抗體。篩選催化性單克隆抗體所用的ELISA與篩選一般抗體的方法不完全一樣，應(yīng)根據(jù)催化反應(yīng)的特點而進行適當(dāng)?shù)男薷?。?jīng)典的方法是先篩選出與底物或半抗原結(jié)合的抗體，然后從中再篩選出有催化活力的抗體，這種方法費時費力。利用催化性抗體對底物的催化活性，對底物進行適當(dāng)修飾，使催化反應(yīng)的產(chǎn)物可直接表現(xiàn)抗體的催化活性，這樣可以簡化檢測步驟。

轉(zhuǎn)換態(tài)類似物半抗原的設(shè)計，必須了解催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)換態(tài)模型的結(jié)構(gòu)特點。催化抗體的抗原結(jié)合位點上與轉(zhuǎn)換態(tài)互補的某些催化基團的形成，能穩(wěn)定轉(zhuǎn)換態(tài)分子。此外有人把單克隆抗體分子用化學(xué)修飾方法引入一些活性基團，提高催化性抗體的催化與親和效率。應(yīng)用噬菌體抗體文庫也可以篩選催化性抗體，可省去制備轉(zhuǎn)換態(tài)類似物的復(fù)雜過程，直接用底物從文庫中篩選有催化活性的抗體片段。如用半抗原免疫后制備的文庫或文庫經(jīng)過多次混雜重組，則可以得到更高的親和力的催化性抗體。抗獨特型抗體也用于催化性抗體的制備，用酶作為抗原免疫小鼠獲得能夠封閉酶活性位點的單克隆抗體，將這個抗體用蛋白酶除去Fc片段，用Fab免疫其他品系的小鼠或家兔，得到的抗體具有相應(yīng)的酶催化活性醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理。

從理論上看，B細胞具有全套免疫球蛋白的多樣性的胚系基因，當(dāng)然也包括有催化作用的自身抗體在內(nèi)。然而1989年P(guān)aulW.首次報道了人體的一種能催化蛋白質(zhì)水解的免疫球蛋白。它是—種自身抗體，能水解血管活性腸肽（vasoactiveintenstinalpeptide，VIP）的Glnl6—Met17鍵。用VIP作為抗原能得到有催化作用的單克隆抗體，也能催化Glnl6—Met17鍵。大約有17%的人有這種自身抗體酶，但患有氣喘的病人中該抗體與VIP的親和力比健康人高50倍。由于VIP是一種氣管松弛劑，因此有人認為這種VIP自身抗體的長期作用可能與氣喘的過敏應(yīng)答有一定關(guān)系。由此推測除了人工設(shè)計催化抗體以及發(fā)現(xiàn)的自身催化抗體外，用篩選單抗的方法，也有可能找到所需要的催化抗體。